Will Smith trong vai Trung tá Robert Neville: Một cựu nhà virus học của Quân đội Hoa Kỳ trước bệnh dịch trên toàn thế giới, anh mất vợ và con gái trong một vụ tai nạn trực thăng ngay sau khi Manhattan bị cách ly và dành ba năm tiếp theo để cố gắng tìm cách chữa trị trong khi tự bảo vệ mình trước Người bóng tối. Anh miễn nhiễm với virus và sử dụng các lọ máu của mình để cố gắng tạo ra một phương pháp chữa bệnh.
Alice Braga trong vai Anna Montez: Một người sống sót từ Brazil, cô đã trải qua nhiều ngày bị giam giữ trên một con tàu của Hội Chữ thập đỏ ở Philadelphia. Sau khi thành phố bị tràn ngập, cô ở lại với Ethan và một số người sống sót khác trên con tàu, nhưng cuối cùng chỉ có Ethan và cô sống sót vì họ đã được miễn dịch và những người khác đều bị nhiễm bệnh hoặc bị giết. Cô theo dõi chương trình phát sóng của Neville để tìm kiếm anh.
Charlie Tahan trong vai Ethan: Một cậu bé đến từ Philadelphia, người đã dành thời gian trên con tàu của Hội Chữ Thập Đỏ cùng với Anna và đi cùng cô khi con tàu bị tràn.
Emma Thompson trong vai Tiến sĩ Alice Krippin: bác sĩ tạo ra thuốc chữa ung thư, cô đã vô tình đưa nhân loại đến bờ vực diệt vong. Neville đặt tên cho virus là "virus Krippin".
Salli Richardson trong vai Zoe Neville, vợ của Robert
Willow Smith trong vai Marley Neville, con gái của Robert
Dash Mihok trong vai Alpha Male, nam giới thống trị của các dị nhân giống ma cà rồng, Người bóng tối, quyết tâm giành lại vợ của mình từ Neville, bất chấp việc Neville xem chúng là những sinh vật vô tâm và vô cảm.
Joanna Numata trong vai Alpha Female, vợ của Alpha Male, người bị Neville bắt và được dùng làm đối tượng để chữa bệnh.
Darrell Foster trong vai Mike
Pat Fraley trong vai giọng nói của Tổng thống Hoa Kỳ
